Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Однако этот документ также может быть использован в качестве основы для валидации амплификации нуклеиновых кислот в общем.
Для целей данного документа, за аналитическую процедуру принимают всю процедуру от экстракции нуклеиновой кислоты до детекции амплифицированного продукта.
При использовании в аналитическом методе или его части коммерческого набора, валидацию пользователя может заменить документированное подтверждение валидации вышеуказанных положений, произведенной изготовителем набора. Тем не менее, пользователем должна быть продемонстрирована производительность набора в отношении его предполагаемого использования (т.е. предел детекции, устойчивость, перекрестная контаминация).
2. СПЕЦИФИЧНОСТЬ
Специфичность представляет собой способность к однозначной оценке присутствия нуклеиновой кислоты в смеси с компонентами, присутствие которых можно ожидать.
Специфичность аналитических методов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот, зависит от выбора праймеров, выбора зонда (для анализа конечного продукта) и обоснованности условий проведения испытания (как для стадии амплификации, так и для стадии детекции).
При разработке праймеров и зондов должна быть исследована их специфичность в отношении детектирования только РНК HCV путем сравнения избранной последовательности с последовательностями, опубликованными в банках данных. В случае HCV праймеры (и зонды) обычно выбирают из областей 5’-некодируемого участка генома HCV, которые хорошо сохраняются для всех генотипов.
Амплифицированный продукт должен однозначно идентифицироваться одним из многих методов, например, проведением амплификации с вложенными праймерами, анализ с использованием ферментов рестрикции, секвенирование или гибридизация со специфическим зондом.
Для валидации специфичности аналитического метода испытание должно быть проведено в отношении не менее 100 РНК HCV-отрицательных пулов плазмы, для которых должно быть показано отсутствие реакции. Подходящие образцы пулов, не дающих реакции, могут быть получены в Европейском директорате по качеству медицинских препаратов.
Способность аналитического метода к детекции всех генотипов HCV также зависит от выбора праймеров, зондов и параметров метода. Эта способность должна быть продемонстрирована с использованием характеризованных эталонных панелей. Однако, ввиду сложности получения некоторых генотипов (например, генотипа 6), должны быть на подходящем уровне детектированы генотипы преобладающих типов (например, в Европе - генотипы 1 и 3).
3. ПРЕДЕЛ ДЕТЕКЦИИ
За предел детекции данной аналитической процедуры принимают наименьшее количество нуклеиновой кислоты в образце, которое может быть детектировано, но не обязательно определено как точное значение. Аналитический метод с использованием амплификации нуклеиновых кислот, используемый для детекции РНК HCV в пулах плазмы, обычно дает качественные результаты. Количество возможных результатов ограничено двумя: либо положительным, либо отрицательным. Хотя рекомендуется определение предела детекции, в практических целях для аналитического метода на основе амплификации нуклеиновых кислот должно быть определено положительное граничное значение. Положительное граничное значение (в соответствии с определением в общем разделе 2.6.21) представляет собой минимальное количество последовательностей-мишеней в объеме образца, которые могут быть определены в 95% испытаний. На это положительное граничное значение оказывают влияние распределение вирусных геномов в индивидуальных испытуемых образцах и такие факторы, как эффективность фермента. Это может привести к получению различных 95% граничных значений для отдельных испытаний.
Для определения положительного граничного значения ряд разведений рабочего реагента или стандартного образца вируса гепатита С BRP, калиброванного в сравнении с Международным Стандартом HCV ВОЗ 96/790, должен быть подвергнут испытанию в разные дни для проверки изменчивости результатов
анализа. Для проведения статистического анализа результатов должно быть испытано не менее трех независимых рядов разведений в количестве повторностей для каждого из разведений, достаточном для получения всего 24 результатов испытания для каждого разведения.
Например, в лаборатории в разные дни могут быть проведены испытания трех рядов разведений в восьми повторностях для каждого из них, четырех рядов разведений в шести повторностях для каждого из них или шести рядов разведений в четырех повторностях для каждого из них. Для того, чтобы число разведений не было слишком большим, следует провести предварительное испытание (например, с использованием логарифмических разведений образца пула плазмы) с получением предварительного положительного граничного значения (т.е. наибольшего значения, дающего положительный результат). После этого диапазон разведений может быть выбран в области полученного предварительного значения (с использованием, например, логарифмического фактора разведения
0,5 или менее и отрицательного пула плазмы для матрицы разведения). Концентрация РНК HCV, которая может быть детектирована в 95% испытаний, может быть вычислена с использованием соответствующих методов статистической оценки.
